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Optimisation des inhibiteurs puissants de la P. falciparum Dihydroorotate déshydrogénase pour le traitement du paludisme

Le paludisme demeure un problème de santé mondial majeur et endémique dans 87 pays où 2,5 milliards de personnes Bien qu’un certain nombre de chimiothérapies hautement efficaces aient été développées au fil des années, l’évolution généralisée de la résistance a rendu la plupart des choses limitées.2,3 De plus, l’efficacité clinique réduite des dérivés de l’artémisinine de première ligne souligne le besoin urgent de nouvelles En raison de notre intérêt pour l’étude de l’inhibition de nouvelles cibles biologiques, nous avons collaboré avec Medicines for Malaria Ventu re à la recherche de petites molécules inhibitrices de PfDHODH. L’inhibition de la DHODH humaine, quatrième étape de la voie de novo et étape limitante de la synthèse des pyrimidines, s’est révélée efficace en clinique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, aboutissant à l’approbation du léflunomide en 19986. la cellule mammifère, le parasite est incapable de récupérer les pyrimidines et dépend de la voie de novo pour l’approvisionnement en pyrimidines pour la survie. Au cours des dernières années, plusieurs études sur la synthèse d’inhibiteurs puissants et sélectifs de PfDHODH ont été signalées comme de nouvelles cibles potentielles pour le traitement du paludisme.7 Phillips a récemment rapporté le premier exemple d’inhibiteur de PfDHODH efficace sur un modèle murin de paludisme. Auparavant, nous avions signalé que l’analogue 1d du benzimidazole avait des propriétés physicochimiques améliorées et une activité comparable par rapport à l’atteinte initiale identifiée à partir d’un criblage à haut débit (Figure 11) .9 Récemment, nous avons révélé que le traitement des souris infectées le modèle d’efficacité aigu de P. berghei avec 2e a entraîné une guérison stérile.10 Nous avions également divulgué les données d’activité in vitro et les données ADME pour deux autres analogues avancés 2j et 2q.10 Dans cette lettre, nous décrirons notre stratégie de chimie médicinale, structure et # x02013; relation d’activité (SAR), et synthèse conduisant aux composés 2e, 2j et 2q Plus précisément, nous décrirons comment nous avons atténué les limitations d’inhibition du CYP et du hERG et de fournir des données in vivo générées récemment qui ont abouti à la sélection du composé 2q en tant que candidat potentiel au développement de médicaments (Figure 11). Figure 1 Structures des composés 1 et 2. Le SAR était basé sur le PfDHODH enzymatique. l’activité et confirmée dans un test à base de cellules contre les souches sensibles à la drogue et résistantes aux médicaments de P. falciparum 3D7 et Dd2. Dans certains cas (Tableau 2), les composés semblent être plus actifs dans le test cellulaire que le dosage enzymatique PfDHODH puisque le test enzymatique a été effectué à 12,5 nM, limitant notre capacité à mesurer l’inhibition dans les plages nanomolaires très faibles. Notre point de départ de la chimie médicinale était le composé 1d, et la première région que nous avons étudiée était l’effet de la substitution à l’amide secondaire (tableau 1). Il était clair à partir des amides primaires et tertiaires 1a et 1j qu’un amide secondaire était crucial pour l’activité puisque ces deux composés étaient inactifs dans le test enzymatique PfDHODH (IC50 > 30 μ M). Une autre observation frappante a été la sensibilité de l’activité PfDHODH et de l’activité cellulaire aux changements subtils de la taille stérique de l’amide. Par exemple, les valeurs PfDHODH IC50 pour les composés lb (Me), 1c (Et), 1d (n-Pr) et 1h (n-Bu) étaient de 1,08, 0,14, 0,70 et 28,6 μ Diminution de 200 fois de l’activité entre les analogues Et et n-Bu. Bien que l’analogue Etc soit le plus puissant de cette série, une augmentation modérée de la puissance a été observée lorsque le substituant a été remplacé par un cycle c-Pr 1f avec une CI50 de 0,06 &numsp &numsp &numsp M. Cela a été vérifié par les valeurs IC50 3D7 et Dd2, qui étaient respectivement de 0,08 et 0,09 μ Ces données suggèrent que le groupe cyclopropyle occupait une poche hydrophobe définie, ce qui a été confirmé par une structure cristalline aux rayons X provenant du laboratoire Philips de 2e lié à PfDHODH.10. Preuve supplémentaire que le groupe c-Pr occupait une poche hydrophobe définie a été fournie par la diminution de la puissance qui a été observée à mesure que la taille du cycle augmentait progressivement. Par exemple, en passant de c-Pr 1f à c-pentyl 1i, la puissance a diminué de 40 fois.Tableau 1Enzyme Inhibition et viabilité parasitaire du composé 1aHaving a déterminé qu’un amide secondaire substitué par un groupe c-Pr offre la puissance optimale, nous Nous avons porté notre attention sur l’effet de la substitution en position 2 du cycle benzimidazole (Tableau 1).Une simple substitution d’un groupe méthyle 1k a donné une puissance comparable à l’analogue non substitué 1f, avec une CI50 de 0,08 contre 0,06 & mgr; mais plus important encore, il y a eu une amélioration de la stabilité métabolique hépatique in vitro basée sur les données dans les microsomes humains. (données non montrées). L’augmentation de la masse stérique en position 2 avec un groupe éthyle 1l ou n-Pr 1m n’était pas bénéfique d’un point de vue de puissance ou d’ADME. De plus, l’addition d’un groupe hydroxyle polaire 1n ou du groupe diméthylamino 1p était également préjudiciable à l’activité. Les composés la ont été préparés comme indiqué dans le schéma 1. Le couplage de l’acide 5-bromothiophène-2-carboxylique 3a avec le benzimidazole dans la présence d’une quantité catalytique de Cu20 et de 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidine a fourni l’intermédiaire clé 3c, qui a subi un couplage DCC avec diverses amines disponibles dans le commerce pour donner les amides secondaires la. Inversement, les composés 1k – n et 1p ont été obtenus par couplage catalysé par Cu (I) du 5-bromo-N-cyclopropylthiophène-2-carboxamide 3b avec les benzimidazoles 2-substitués correspondants en présence de quantités catalytiques de Cu2O et 4 7-diméthoxy-1,10-phénathroline.11 Schéma 1 Le schéma de substitution du cycle thiophène a été évalué. Le schéma de 2,5-substitution s’est avéré optimal puisque les substitutions 2,4 et 3,4 ont entraîné une perte significative de la puissance. Des remplacements du cycle thiophène ont également été examinés et ceux-ci comprenaient le phényle méta- et para-substitué, le N-méthylpyrrole substitué en position 2,5, le pyrrole, le thiazole, le furane et l’oxazole (données non présentées). Aucun de ces remplacements n’a résulté en une activité appréciable autre que le N-méthylpyrrole substitué en 2,5, qui était approximativement 3 fois moins actif que le thiophène correspondant. Bien que cette série n’ait pas été activement poursuivie, elle a été considérée comme une piste de secours importante. Ensuite, nous avons étudié l’effet de la substitution sur le cycle benzimidazole (Tableau 2). La simple marche d’un groupe méthyle autour de l’anneau de la position 4 à la position 7 (2a – d) a entraîné une augmentation d’environ 2 fois de l’activité des analogues 2a – c par rapport à 1k mais réduction de la puissance de l’analogue 7-méthyl 2d, suggérant un blocage stérique en position 7. Ceci a été confirmé par l’analogue 2w de 5-Me, 7-F (tableau 2), qui est isostérique par rapport à l’analogue de 5-Me 2b et avait une activité enzymatique comparable. Fait intéressant, la substitution par des groupes attracteurs d’électrons tels que CF3 (2g, 2h) et OCF3 (2e, 2f) aux positions 5 et 6 indique que les groupes hydrophobes en position 5 procurent une amélioration de 3 fois. en puissance par rapport à la 6-substitution. Plus prononcée était la différence dans l’activité cellulaire, par exemple, les valeurs IC7 3D7 et Dd2 étaient de 7 et 9 nM vs 36 et 53 nM (analogue de 5-OCF3 2e et 6-OCF3 analogue 2f). Sur la base de la puissance observée et du profil ADME raisonnable, 2e a été sélectionné pour les études d’efficacité10. Cependant, bien que 2e ait été curatif lorsqu’il a été administré par voie orale dans le modèle d’efficacité de P. berghei (souche ANKA), 10 il présentait des responsabilités ADME significatives. Plus précisément, il y avait un potentiel d’interactions médicamenteuses avec une CI50 observée de 0,1 μ M pour l’isoenzyme CYP2D6 et un risque potentiel de sécurité cardiovasculaire basé sur une valeur hERG IC50 de < 2.8 μ M. Tableau 2 Inhibition de l'enzyme, viabilité des parasites et stabilité microsomique du composé 2a Nous avons déterminé que les propriétés de l'ADME pouvaient être améliorées en réduisant la lipohilicité mesurée par cLogP. Notre première stratégie consistait à mettre l'accent sur les substituants 4 puisque l'analogue 4a de 2-Me était approximativement 3 fois plus puissant que les analogues de 5-Me et 6-Me 2b (Tableau 2) dans la cellule. Tests 3D7 et Dd2. Nous avons été encouragés par l'analogue de 4-OMe 2i plus hydrophile (cLogP de 3,6), qui était 9 fois moins puissant que 2e mais n'inhibait pas hERG ou CYP. Dans le but d'améliorer la puissance, la lipohilicité a été légèrement augmentée en préparant l'analogue 2j de 4-OCHF2 (cLogP de 4,1). De manière satisfaisante, la puissance était approximativement 4 fois plus élevée que 2i, PfDHODH IC50 de 44 contre 162 nM avec une activité cellulaire dans la gamme de 19   26 nM. Plus important encore, l'inhibition du P450 était de > 10 μ M pour les cinq principales isozymes de métabolisation du médicament, et la CI50 hERG était de 28,8 μ M. En conséquence, 2j a été choisi pour une évaluation in vivo plus poussée.10 Bien que 2j ait un profil acceptable, il y avait de la place pour une augmentation de la puissance. En conséquence, une série de substituants à la position 4 ont été préparés (Tableau 2), et il a été trouvé que les groupes électro-attracteurs tels que F, Cl, Br et CN (2l – q) fournissaient approximativement 5 – gain de puissance cellulaire par rapport à 2j. Par exemple, la CI50 du composé 4-F 2l était de 8 et 6 nM dans 3D7 et Dd2, respectivement.Cependant, lorsque l’on considère les propriétés physicochimiques, les interactions médicamenteuses potentielles induites par l’inhibition du CYPP450 et la sécurité cardiovasculaire potentielle, l’analogue 2q du 4-CN présente le meilleur profil global. La deuxième stratégie adoptée pour optimiser les propriétés ADME / PK de 2j est pour préparer les analogues de 2-méthylbenzimidazole (2t, 2v, w, 2p) puisque le cLogP a été réduit d’environ la moitié d’une unité de log (tableau 2). Ces composés ont été synthétisés par le couplage catalysé par Cu (I) de 3b avec les benzimidazoles substitués correspondants en présence de quantités catalytiques de Cu20 et de quinolin-8-ol dans du DMSO (Schéma 1). Sur la base du DAS du tableau 1, nous avons prévu que la stabilité métabolique in vitro serait plus faible pour les composés déméthylés, et en effet, c’était le cas. Nous avons été surpris, cependant, d’observer que la sélectivité pour HsDHODH avec les composés des-méthyliques a augmenté dans la gamme de 3100 ڥ 1700 contre > 30000 nM pour les analogues 2-méthyle. En raison de la plus faible sélectivité et de la faible stabilité métabolique in vitro, ces composés n’ont pas été poursuivis. Les analogues 5 et 6 substitués ont été préparés par le couplage catalysé par Pd (0) des 1-bromo-2-nitrobenzènes substitués de manière appropriée ( 4b – c), 4f – k) (Schéma 2) avec 3d en présence de Xantphos pour donner les intermédiaires 5 avec un bon rendement similaire à une procédure rapportée par Hornberger et al.12 Les intermédiaires 5 ont été facilement transformés en la cible composés (2b – c, 2e – k, 2x) en utilisant la séquence de quatre étapes suivante. Le groupe nitro de 5 a été réduit en l’aminé par hydrogénation en présence de Pd (OH) 2 / C suivie d’une cyclisation avec (EtO) 3CMe pour donner les benzimidazoles substitués. Pour achever la synthèse, l’ester a été hydrolyse en l’acide en utilisant LiOH, qui a ensuite été converti en le cyclopropylamide par l’intermédiaire du chlorure d’acide. Il convient de souligner que lors de la réaction de cyclisation, la substitution (MeO) 3CH pour (EtO) 3CMe a donné le composé des méthyle 2x.Scheme 2Compounds avec des groupes électroattracteurs (F, Cl, CN) en position 4 (2l &#x02013 n, 2q) ont été synthétisés par le couplage direct de benzène 3-fluoro-2-nitro (substitué) (4l-o, 4q) avec 3d en présence de KOH et de quantités catalytiques de BnEt3NCl dans du DMF pour donner les intermédiaires 5a. Pour la synthèse du nitrile 2q, le groupe nitro de 5a a été réduit avec SnCl2 dans HCl, puis cyclisation en benzimidazole et hydrolyse de l’ester comme décrit ci-dessus. Cependant, pour éviter les réactions secondaires avec le nitrile, l’amide a été formé par une méthodologie de couplage peptidique en utilisant HCTU et la cyclopropylamine pour obtenir le 5- (4-cyano-2-méthyl-lH-benzo [d] imidazol-l-yl) -N- Nous avons examiné la sélectivité des espèces pour la série et nous avons constaté que les composés présentaient une activité équipotente contre DHODH de P. falciparum, P digestif. vivax et P.berghei, un attribut important pour le développement d’un candidat. avec activité pan-parasite. De plus, 2a – s et 2u manquent d’activité contre l’enzyme humaine (HsDHODH IC50 > 30 μ M). La série a également montré une excellente corrélation entre l’activité enzymatique (DHODH de P. falciparum, P. berghei et P. vivax) et l’activité cellulaire (3D7 et Dd2), suggérant que la spécificité d’espèce pour l’inhibition de DHODH corrèle avec un effet spécifique sur les parasites par rapport aux cellules représentatives des mammifères. Des données in vivo et in vitro supplémentaires pour le composé 2q, y compris des études de toxicité à doses répétées de 7 jours chez les rongeurs, ont été réalisées (tableau 3). La pharmacocinétique de 2q chez le rat et le chien a été déterminée, et sa biodisponibilité orale modérée (F%) était de 49 et 19%, respectivement. Le profil ADME in vitro était encourageant, en particulier la faible clairance métabolique hépatique prédite, déterminée dans les microsomes et les heptocytes humains, respectivement de 0,6 mL / min / kg et de 0,7 et 0,0003c; Dans une étude de toxicologie à doses répétées chez le rat à 0, 50, 150, 450 et 600 mg / kg PO QD pendant 7 jours suivie d’une période d’élimination de 7 jours, la NOAEL était de 600 mg / kg (Cmax, 29 μ g / mL; ASC, 328 μ g * h / mL), et la marge thérapeutique humaine prévue était > 5.5. Aucune activité hors cible dans un panel de pharmacologie à 54 récepteurs (Cerep ExpresSProfile) à 10 μ M n’a été observée corroborant l’activité cible contre pfDHODH. De plus, un test d’Ames utilisant Salmonella typhimurium TA98, 100 et 1535, avec et sans induction par S9, n’a révélé aucune activité à des concentrations allant jusqu’à 100 μ M.Table 3Pharmacokinetics, in vitro ADMEa Properties et in Vivo Efficacy de 2q Enfin, l’efficacité de 2q a été évaluée par l’administration de PO dans deux autres modèles murins de paludisme, les modèles P. berghei ANKA et P. falciparum 3D70087 / N9, et les valeurs ED50, ED90 et ED99 de 13 à 62 mg / kg / jour, démontrant la puissance prédite.Sur la base de ces données et des données précédemment rapportées10 [11% fraction libre du médicament dans le plasma humain, pas d’inhibition du P450 (IC50 > 10 μ M), hERG IC50 de 53 μ M], 2q En conclusion, nous avons réussi à optimiser une avance précoce pour générer un nouveau composé de faible poids moléculaire qui est biodisponible oralement chez trois espèces et efficace dans trois modèles murins de paludisme. Sur la base de ces résultats et des propriétés druglike favorables, 2q a été choisi comme candidat potentiel au développement de médicaments.